⑦对二甲氨基苯甲醛／乙酰丙酮
检出物：氨基糖类。
溶液：I. 5ml 50％氢氧化钾溶液与20ml乙醇混匀，取此溶液0.5ml，加乙酰丙酮0.5ml与正丁醇50ml的混合液l0ml，此两种溶液均需新鲜配制，临用前混合；
  Ⅱ. 1g对二甲氨基苯甲醛溶于30ml乙醇中，再加30ml浓盐酸，需要时此溶液可用正丁醇180ml稀释。
方法：先喷I后于105oC加热5min，再喷Ⅱ，然后于90℃干燥5min。
结果：斑点呈红色。
(12)杀虫剂
  ①甲基黄
检出物：氯化杀虫剂及抗菌化合物。
  溶液：O.1g甲基黄于70ml乙醇中，加25ml水并用乙醇稀释至l00ml。
方法：喷板后于室温干燥，并在无滤光片紫外光下照射5min。
  结果：黄色背景上呈红色斑点。
  ②溴／四氯化碳
  检出物：有机磷杀虫剂。
  溶液：10％溴的四氯化碳溶液。
  方法：薰溴蒸气。
③锰／水杨醛
  检出物：有机硫代磷杀虫剂。
  溶液：I．100mg氯化锰溶于100ml 80％乙醇；
    Ⅱ．溶解1.3g 2-肼喹啉于小量热乙醇中，溶1g水杨醛于5ml乙醇并加1～2滴冰醋酸，合并两溶液并回流30min，冷却后析出水杨-2-醛-2-喹啉腙沉淀，并用乙醇重结晶。用50mg此衍生物溶于100ml乙醇中。
  方法：等量溶液I及Ⅱ混合后，喷板。
  ④二苯胺／氯化锌
  检出物：氯化杀虫剂(DDT、CPCA、氯-DDT、克菌丹、甲氧氯、毒杀芬)。
  溶液：二苯胺及氯化锌各0.5g溶于100ml丙酮中。
  方法：喷后200oC加热5min。
  ⑤溴／荧光素／硝酸银
  检出物：杀虫剂。
  溶液；I．5％溴的四氯化碳溶液；
    Ⅱ．1ml 0.25％荧光素的二甲基甲酰胺溶液，用乙醇稀释至50ml；
    Ⅲ．1.7g硝酸银溶于5ml水中，加2-苯氧基乙醇，用丙酮稀释至200ml。
  方法：展开后的薄层置试液I容器中薰30s，取出先喷溶液Ⅱ，再喷溶液Ⅲ，再置紫外光下7min。
  (13)黄酮类
  ①乙醇胺二苯硼酸盐
  检出物：黄酮类。
  溶液：I. 1％乙醇胺二苯硼酸盐的甲醇溶液；
    Ⅱ. 5％聚乙二醇的乙醇溶液。
  方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ使荧光稳定，再在紫外光长波下照射2min。
  结果：紫外灯下观察荧光。
  ②三氯化锑
  检出物：黄酮类。
  溶液：10％三氯化锑的氯仿溶液。
  方法：喷板。
  结果：紫外光长波下呈荧光。
  ⑧三氯化铝
  检出物：黄酮类。
  溶液：1％三氯化铝乙醇溶液。
  方法：喷板。
  结果：紫外光长波下显黄色荧光。
  ④Benedict(硫酸铜／枸橼酸钠)试剂
  检出物：含邻二羟基的黄酮类及香豆精类。
  溶液：1.73g 硫酸铜(CuS04•5H20)：17.3g 枸橼酸钠及10g 无水碳酸钠溶于水并稀释至1 00ml。
  方法：喷板。
结果：紫外光长波下观察，含邻二羟基的化合物，斑点荧光减弱或猝灭。
  (14)含硫化合物
  ①硝普钠
检出物：巯基-SH基(半胱氨酸)、双硫化物、-s-s-基(胱氨酸)及精氨酸。
溶液：I. 1.5g 硝普钠溶于5ml 2mol／L盐酸溶液及95ml甲醇中，加10ml 25％氢氧化铵溶液，过滤，即得；
    Ⅱ. 2g氰化钠溶于5ml水，用甲醇稀释至100ml。
方法：先喷溶液I、再喷溶液Ⅱ。
结果：巯基化合物呈红色；精氨酸由橙变为灰蓝色；双硫化物在黄色背景上显红色。
  ②FCNP(硝普钠／铁氰化物)试剂
检出物：脂肪族含硫化台物，如氨基氰、硫脲及其衍生物。
  溶液：10％氢氧化钠溶液、10％硝普钠溶液，10％铁氰化钾溶液与水按1：1：1：3混合，用前与等体积丙酮混合，用时新鲜配制。
○3氯化铁／磺基水杨酸
  检出物：硫代磷酸酯类。
  溶液：I．1％氯化铁的80％乙醇溶液；
      Ⅱ．1％磺基水杨酸的80％乙醇溶液，
  方法：薄层先置溴蒸气中10min后，喷溶液I，干燥15min，再喷溶液Ⅱ。
  结果：紫色背景上呈白色。   、 ：
  ④叠氮化碘
  检出物：含硫氨基酸、硫化物与青霉素。
  溶液：叠氮碘溶液-叠氮钠3g 溶乎100ml 0.05mol／L碘溶液中(新鲜配制，固体叠氮碘有爆炸性)。
  ⑤靛红／硫酸
  检出物：噻吩衍生物。
  溶液；0.4g靛红溶于100ml浓硫酸中。
方法：喷板后120oC加热。
  结果：呈不同颜色。
  (15)类脂化合物
  ①磷钼酸
  检出物：胆酸、类脂化物、脂肪酸及甾类。
  溶液：250mg 磷钼酸于50ml乙醇中。
  方法：唆后予120oC加热。
  ②罗丹明6G
  检出物；类脂化物。
  溶液：lg 罗丹明6G溶于100ml丙酮中．
  方法：喷后置紫外光长波下观察。
  ③溴百里酚蓝
  检出物：类脂化物。
  溶液：O．04g溴百里酚蓝溶于100ml O．01mol／L氢氧化钠溶液中。
  (16)阳离子
  ①双硫腙
  检出物：金属离子。
  溶液：20mg双硫腙溶于100ml丙酮中，置棕色瓶中于冰箱内保存。
  方法：上述溶液喷板后再喷25％氢氧化铵溶液。
  ②红氨酸 (二硫代草酰胺)
  检出物：重金属离子。
  溶液：0.5％红氨酸乙醇溶液。
  方法：先喷上述溶液，稍干后置薄层于氨蒸气中。。
  ③茜素
  检出物：众多阳离子、稀土及铀。
  溶液：茜素乙醇饱和溶液。
  方法：喷板后直接放入氨蒸气中。
  ④亚铁氰化钾
  检出物：Fe3+、Cu2+、Cl、Mo、V、W离子。
  溶液：新配制的2％亚铁氰化钾溶液。
⑤二苯卡巴肼
  检出物：Ag+、pb2+、Hg2+、Cu2+、Sn2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Co2+及Ca2+离子。
  溶液：I．1％～2％二苯卡巴肼乙醇溶液；
      Ⅱ．25％氢氧化铵溶液。
  方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ。
  结果：Ni2+呈蓝色、Co2+呈橙褐色、Zn2+呈红紫色，Ag+、pb2+、Cu2+、Sn2+、Mn2+呈褐色、乙酸汞加成物于80oC加热片刻，斑点呈蓝色。
  (17)阴离子
  ①硝酸银
  检出物：含硫阴离子、砷酸盐、亚砷酸盐磷酸盐、亚磷酸盐及除氟外的卤素。
  溶液：0.1～0.5mol／L硝酸银溶液中加氨水直至沉淀溶解。临用前配制、储存会形成易爆物质。
  方法：喷后于110～120oC加热l0min，必要时置紫外光下l0min。
②硝酸银／氢氧化铵／荧光素
  检出物：卤素离子。
  溶液：I．1g硝酸银溶于l00ml O.5mol／L氢氧化铵溶液中；
      Ⅱ．1g荧光索溶于l00ml乙醇中。
  方法：先喷溶液I，稍干，再喷溶液Ⅱ。
  ③钼酸铵／亚硫酸钠
  检出物：硫化物、硫代硫酸盐与磷酸盐。   ：
  溶液：I．5％钼酸铵的lmol／L硫酸溶液；
      Ⅱ．5％亚硫酸钠溶液。
  方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ，于105℃加热30min。
  结果：硫化物及硫代硫酸盐呈深蓝色，磷酸盐呈蓝灰色。
  ④番木鳖碱
  检出物：溴酸盐、硝酸盐、氯酸盐。
  溶液：I．0.02％番木鳖碱的lmol／L硫酸溶液；
      Ⅱ．2mol／L氢氧化钠溶液。
  方法：先喷溶液I，再喷溶液Ⅱ。
  结果：溴酸盐、氯酸盐呈血红色，硝酸盐呈橙黄色。
（四）.其他常用与专用显色剂：
碘：
       适用于不饱和或者芳香族化合物
       配制方法：在100ml 广口瓶中，放入一张滤纸，少许碘粒。
                或者在瓶中，加入10g 碘粒，30g 硅胶
高锰酸钾
     适用于含还原性基团化合物，比如羟基，氨基，醛
     配制方法：1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH +200mL 水. 使用期3 个月
磷钼酸(PMA)
      广谱
      配制方法：10 g of 磷钼酸+100 mL 乙醇
      紫外灯
      适用于含共轭基团的化合物，芳香化合物
硫酸铈：
生物碱
     配制方法：10%硫酸铈(IV)+15%硫酸的水溶液氯化铁
苯酚类化合物
      配制方法：1% FeCl3 + 50% 乙醇水溶液.
      桑色素(羟基黄酮)
      广谱, 有荧光活性
      配制方法：0.1% 桑色素+甲醇
茚三酮
     适用于氨基酸
     配制方法：1.5g 茚三酮+ 100mL of 正丁醇+ 3.0mL 醋酸
二硝基苯肼(DNP)
          适用于醛和酮
          配制方法：12g 二硝基苯肼+ 60mL 浓硫酸+ 80mL 水+ 200mL乙醇
香草醛(香兰素)
        广谱
        配制方法：15g 香草醛+ 250mL 乙醇+2.5mL 浓硫酸
溴甲酚绿
       适用于羧酸，pKa<=5.0
       配制方法：在100ml 乙醇中，加入0.04g 溴甲酚绿，缓慢滴加0.1M的NaOH 水溶液，刚好出现蓝色即至。
钼酸铈
广谱
     配制方法：235 mL 水+ 12 g 钼酸氨+ 0.5 g 钼酸铈氨+ 15 mL浓硫酸
茴香醛(对甲氧基苯甲醛)1
     广谱
     配制方法：135 乙醇+ 5 mL 浓硫酸+ 1.5 mL of 冰醋酸+ 3.7 mL茴香醛，剧烈搅拌，使混合均匀.
茴香醛(对甲氧基苯甲醛)2
     适用于萜烯，桉树脑(cineoles), withanolides, 出油柑碱(acronycine)
     配制方法：茴香醛:HClO4:丙酮:水(1:10:20:80)经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。

TLC技术原理与应用（八）

被分离物质的性质
被分离的物质与吸附剂，洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素，彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下，各个成分的分离情况，直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言，成分的极性大，吸附住强。当然，中草药成分的整体分子观是重要的，例如极性基团的数目愈多，被吸附的住能就会更大些，在同系物中碳原子数目少些，被吸附也会强些。总之，只要两个成分在结构上存在差别，就有可能分离，关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质，吸附剂的吸附强度，与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯，或虽含氧但非极性基团，则需选用吸附性较强的吸附剂，并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大，则需要选择吸附性能较弱的吸附剂（一般Ⅲ～Ⅳ级）。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增，或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外，能否获得满意的分离，还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物，象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。如对于C-27甾体皂甙元类成分，能因其分字中羟基数目的多少而获得分离：将混合皂甙元溶于含有5％氯仿的苯中，加于氧化铝的吸附柱上，采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝，由于硅酸镁的吸附性较弱，洗脱剂的极牲需相应降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明，同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时，需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果，从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。
　　（二）簿层层析：薄层层析是一种简便、快速、微量的层析方法。一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃片上，形成一薄层进行层析时一即称薄层层析。其原理与柱层析基本相似。
1．薄层层析的特点：薄层层析在应用与操作方面的特点与柱层析的比较。
2．吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。
3．展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。但在实际工作中，经常需要利用溶剂的极性大小，对展开剂的极性予以调整。
薄层色谱小知识
1、怎样提高点样效率？ 点样是造成TLC定量误差的主要来源。
实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管理体制的占样误差，建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶课剂清洗干净。在制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易变，过高则会改变展开剂组成；对样品溶解度过高会使样点发生空心现象，常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距离1-2cm底边距离1.5cm;HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm底边距1cm.
2、展开剂的选择
TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性，流动相的选择的目的是使绝大部分样品的Rf值位于0.1－0.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质Rf值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合Rf值，适合的Rf值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成，这种方法较为直观，也较简单。
3、TLC的通用显色方法
理想的显色希望灵敏度高，斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好，斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比，在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得尤为重要，通用显色方法主要有：
1、紫外照射法：方便、不破坏样品；
2、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；
3、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；
4、硫酸溶剂：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。